Badanie kariotypu jest jednym z najczęściej wykonywanych i prawdopodobnie najbardziej znanym badaniem genetycznym. Kariotyp bada się u pacjentów, u których podejrzewa się różnego rodzaju zmiany genetyczne, dlatego jest często oferowanym testem diagnostycznym, wykonywanym w przychodniach genetycznych. Czym jest kariotyp i gdzie badanie kariotypu ma zastosowanie kliniczne? Jakie są ograniczenia tej metody, a także czy istnieje lepsza metoda diagnostyki chorób genetycznych niż badanie kariotypu?

Kariotyp – jedno słowo, dwa znaczenia

Kariotyp to inaczej kompletny zestaw chromosomów znajdujący się w każdej komórce ciała. Jednak uzyskanie obrazu kariotypu nie jest proste, ponieważ może być on uwidoczniony tylko w określonym momencie podziału komórki w tzw. stadium metafazalnym. Na pozostałych etapach życia komórki, chromosomy rozluźniają swoją strukturę, a materiał genetyczny ulegają dekondensacji, czyli rozpleceniu. Przez większość czasu DNA krąży po jądrze komórkowym w formie luźno ułożonej chromatyny.

Każdy zdrowy człowiek posiada 46 chromosomów, z czego 44 stanowią autosomy (pary od 1 do 22), a 2 to allosomy, chromosomy płci XX lub XY (widoczne na poniższej rycinie). Obecność dwóch chromosomów X warunkuje płeć żeńską, a obecność jednego chromosomu X i jednego chromosomu Y – płeć męską. Każdy chromosom złożony jest z dwóch ramion (p- oznacza ramię krótkie oraz q- oznacza ramię długie). Ramiona chromosomów połączone są przewężeniem, tak zwanym centromerem. Układ chromosomów oraz ich ilość są charakterystyczne dla każdego gatunku.

Rycina przedstawia obraz mikroskopowy prawidłowego kariotypu męskiego (obecny jest jeden chromosom X i jeden chromosom Y) [6]

Kariotypem określa się także potocznie badanie diagnostyczne stosowane w genetyce, które pozwala uwidocznić zestaw chromosomów w analizowanej komórce. W zależności od wskazania lekarskiego kariotyp oznaczany jest z leukocytów znajdujących się we krwi obwodowej, z komórek płynu owodniowego czy komórek białaczkowych (czyli zmienionych nowotworowo komórek układu odpornościowego).

Aby wykonać badanie kariotypu, materiał pobrany od pacjenta należy odpowiednio przygotować. Pobraną krew poddaje się hodowli na specjalnych pożywkach z dodatkiem stymulatora wzrostu limfocytów. Hodowla ma za zadanie zwiększyć ilość komórek, aby z łatwością przeprowadzić badanie genetyczne.

Gdy liczba komórek jest wystarczająca do dalszych badań, dodaje się do nich kolchicynę – odczynnik chemiczny, którego zadaniem jest zatrzymanie podziału komórkowego w odpowiednim momencie, kiedy chromosomy są najlepiej widoczne (obecne w postaci tzw. płytek metafazalnych). Następnie komórki poddawane są szokowi osmotycznemu, którego skutkiem jest uwolnienie jąder komórkowych z wnętrza komórek. Tak przygotowane jądra komórkowe nanosi się na szkiełko mikroskopowe.

Mikroskop - badanie kariotypu

Jednym z ostatnich etapów przygotowania materiału genetycznego do badania jest utrwalenie preparatu na szkiełku i wybarwienie. Bez odpowiedniego wybarwienia, chromosomy nie są widoczne pod mikroskopem, dlatego w badaniu kariotypu niezwykle istotne jest ich uwidocznienie z użyciem barwników, które pozwolą na pokazanie konkretnych fragmentów chromosomów (tzw. prążków). Utrwalenie preparatu ma z kolei na celu zwiększenie jego trwałości, co pozwoli na odsunięte w czasie analizy. Dopiero wybarwiony w odpowiedni sposób kariotyp może być następnie przekazany wykwalifikowanym specjalistom genetyki laboratoryjnej i diagnostom do analizy.

Po dokładnej analizie, odpowiednim ułożeniu chromosomów oraz dzięki zastosowaniu zaawansowanych programów komputerowych, przygotowywany jest wynik badania. Wynik kariotypu jest zapisem, który powstaje zgodnie z tzw. konwencją Międzynarodowego Systemu Ludzkiej Nomenklatury Cytogenetycznej (ISCN ang. International System for Human Cytogenetic Nomenclature). Opisuje on wszystkie zmiany jakie zaszły w DNA, z uwzględnieniem konkretnych regionów chromosomów na których zostały zaobserwowane. Zgodnie z tą nomenklaturą podawana jest całkowita liczba chromosomów, zmiany liczby chromosomów i rearanżacje – czyli zmiany w ułożeniu fragmentów chromosomów odbiegające od normy.

 

Kiedy stosuje się badanie kariotypu?

Obecnie badanie kariotypu stosuje się w kilku określonych sytuacjach:

  • jako potwierdzenie rozpoznania niektórych zespołów genetycznych jak np.: Zespół Downa prenatalnie lub postnatalnie,
  • przy badaniu przyczyn niepowodzenia rozrodu,
  • w celu zbadania przyczyny nawracających poronień,
  • w większości nowotworów hematologicznych i w niektórych nowotworach litych (np. mięsak Ewinga), w celu postawienia precyzyjnej diagnozy, ustalenia prognozy lub kwalifikacji do leczenia celowanego.

W przypadku części zespołów genetycznych wstępne rozpoznanie można postawić na podstawie samego fenotypu pacjenta. Przykładem może być tu zespół Downa, w którym pacjenci mają charakterystyczne cechy wyglądu takie jak: skośno-górne ustawienie szpar powiekowych czy obniżone napięcie mięśniowe (hipotonia). Jednak w celu ostatecznego potwierdzenia diagnozy konieczne jest wykonanie badania kariotypu chorego. W przypadku zespołu Downa takie badanie zazwyczaj pokaże obecność jednego dodatkowego chromosomu w parze 21 (taka sytuacja ma miejsce na poniższej rycinie). Tym samym pacjent będzie miał 47, zamiast prawidłowych 46 chromosomów.

Rycina przedstawia kariotyp pacjentki z zespołem Downa. Obecny jest dodatkowy chromosom 21 pary. Łącznie obecnych będzie 47 chromosomów zamiast prawidłowych 46. Taki stan nazywamy trisomią. [7]

Badanie kariotypu dalej pozostaje ważną częścią diagnostyki związanej z ludzką płodnością. W przypadku powtarzających się poronień (2 lub więcej) rodzicom zaleca się badanie kariotypu. Może ono wykazać nieprawidłowości w budowie chromosomów np. przeniesienie fragmentu z jednego chromosomu na inny (tzw. translokacja zrównoważona).

Często takie zmiany nie powodują chorób genetycznych, ponieważ całkowita ilość materiału genetycznego w komórkach nie ulega zmianie. Z kolei podczas produkcji komórek rozrodczych: plemników lub komórek jajowych, jeden z nieprawidłowych chromosomów może zostać im przekazany. Wtedy w komórkach rozrodczych pojawia się niezrównoważenie co najczęściej skutkuje poronieniem. Jest to jedna z przyczyn niepłodności, nawracających poronień, wewnątrzmacicznego obumarcia płodu lub wystąpienia choroby u żywo urodzonego dziecka.

Diagnostyka chorób hematoonkologicznych

Kolejnym ze wskazań do wykonania badania kariotypu jest diagnostyka chorób hematoonkologicznych. Dzięki oznaczeniu kariotypu np. w ostrej białaczce szpikowej (AML, ang. Acute Myeloid Leukemia) lekarze są w stanie przyporządkować pacjentów do różnych grup m.in. ze względu na rokowanie czy możliwość zastosowania konkretnego leczenia. Pewne zmiany widoczne w kariotypie mogą wskazywać na korzystne rokowanie (średnie przeżycie około 7-6 lat) a inne niekorzystne (średnie przeżycie poniżej 1 roku).

Jedna ze zmian kariotypowych, wpływająca niekorzystnie na rokowanie pacjenta została pokazana na znajdującej się poniżej rycinie. W tym badaniu zaobserwowano przeniesienie fragmentu chromosomu (translokację) między chromosomem 6 a chromosomem 9, co zaznaczono strzałkami. Uwidocznienie niektórych zmian pozwala czasami na dopasowanie celowanego leczenia dla konkretnego Pacjenta.

Kiedy na podstawie badania kariotypu stwierdza się przeniesienie fragmentu materiału genetycznego między specyficznymi fragmentami chromosomów 15 i 17, mówi się o podtypie AML – ostrej białaczce promielocytowej (APL, ang. Acute Promyelocytic Leukemia). W tym konkretnym podtypie białaczki, można zastosować terapię celowaną z użyciem kwasu retinowego i trójtlenku arsenu.

Rycina przedstawia kariotyp komórek białaczkowych AML. Strzałkami zaznaczono translokację miedzy chromosomami 6 i 9 [8]

Ograniczenia badania kariotypu

Mimo niewątpliwej użyteczności badania kariotypu, warto zwrócić uwagę na jego ograniczenia. Badanie kariotypu posiada niską rozdzielczość, a więc wykryte mogą być jedynie naprawdę ogromne zmiany genetyczne. Najpopularniejsza technika barwienia chromosomów pozwala na uwidocznienie zmian genetycznych o minimalnej wielkości 5-10 mln par nukleotydów. Dlatego właśnie widoczne będą jedynie zmiany obejmujące duże fragmenty materiału genetycznego. W związku z tym w dużej liczbie chorób genetycznych i nowotworowych konieczne będzie wykonanie kolejnych badań cechujących się większą rozdzielczością, co z kolei opóźni diagnozę i zwiększy koszty.

Istotnym ograniczeniem badania kariotypu jest mała liczba analizowanych komórek. Zdarzyć się może, że w organizmie pacjenta występuje „mozaikowość” co oznacza, że część komórek zawiera trochę inny materiał genetyczny niż pozostałe komórki. W takim przypadku badanie kariotypu może dać błędny wynik badania. Pomimo tego, kariotypowanie jest dalej najlepszą metodą do tego typu testów. Ważny jest także rodzaj pobranego materiału, z którego analizowany będzie kariotyp.

Najlepsza jakość obrazu chromosomów zostanie osiągnięta przy oznaczeniu komórek z krwi obwodowej. W przypadku korzystania np. z komórek płynu owodniowego, jakość uzyskanych chromosomów może być niska.

Kariotyp a sekwencjonowanie materiału genetycznego

Warto zadać sobie pytanie: „czy istnieje badanie diagnostyczne, które jest w stanie przezwyciężyć ograniczenia związane z oznaczaniem kariotypu?”. Istnieje kilka technik, które są w stanie w pewien sposób zastąpić to badanie, jednak jedna z nich wydaję się nieść za sobą najwięcej korzyści. Technologią tą jest sekwencjonowanie całogenomowe (z ang. Whole Genom Sequencing, WGS).

Badanie to polega na sekwencjonowaniu całego obecnego w komórce DNA. Dzięki temu uzyskujemy możliwość wykrycia większości zmian genetycznych jednym testem diagnostycznym. Możliwe jest wykrycie zmian bardzo dużych, takich które wykrywa badanie kariotypu, jak również zmian dotyczących pojedynczych nukleotydów. Badanie całego genomu jest efektywne finansowo oraz skraca czas postawienia diagnozy, szczególnie w przypadku chorób, których lekarz nie jest w stanie zidentyfikować na podstawie fenotypu chorego, np. niepełnosprawności intelektualnej czy też w przypadku diagnostyki nowotworów złośliwych. Badanie całego genomu posiada jeszcze jedną, bardzo ważną cechę – może być przeprowadzony także na komórkach, które nie ulegają podziałom komórkowym. Badanie można wykonać także na komórkach martwych (materiał sekcyjny) bez większego wpływu na jakość wyników.

Oczywiście WGS nie jest metodą pozbawioną wad. Nie pozwala ona na skuteczne wykrywanie mozaikowatości a także mutacji dynamicznych (czyli takich w których występują wielokrotne powtórzenia pewnych nukleotydów np. kilkadziesiąt następujących po sobie CAG). Pomimo kilku ograniczeń, istnieje duża szansa, że w niedalekiej przyszłości WGS stanie się złotym standardem diagnostyki genetycznej w krajach rozwiniętych.

Zapamiętaj

  • Kariotyp to termin określający albo zbiór chromosomów danej komórki albo rodzaj badania genetycznego, w którym analizuje się chromosomy.
  • Prawidłowy ludzki kariotyp zawiera 46 chromosomów.
  • Oznaczenie kariotypu jest obecnie złotym standardem w: identyfikacji zespołów wad wrodzonych, przyczyn niepowodzeń rozrodu, nawracających poronienia czy niektórych chorób nowotworowych.
  • Kariotyp jest badaniem, które wykrywa tylko niektóre zmiany genetyczne takie jak np. obecność dodatkowego chromosomu.
  • Sekwencjonowanie całogenomowe ma szanse stać się nowym złotym standardem diagnostyki genetycznej.

Źródła:

[1] Lindstrand A, Eisfeldt J, Pettersson M, Carvalho CMB, Kvarnung M, Grigelioniene G, et al. From cytogenetics to cytogenomics: Whole-genome sequencing as a first-line test comprehensively captures the diverse spectrum of disease-causing genetic variation underlying intellectual disability. Genome Med 2019;11:1–23. doi:10.1186/s13073-019-0675-1.

[2] Shah MS, Cinnioglu C, Maisenbacher M, Comstock I, Kort J, Lathi RB. Comparison of cytogenetics and molecular karyotyping for chromosome testing of miscarriage specimens. Fertil Steril 2017;107:1028–33. doi:10.1016/j.fertnstert.2017.01.022.

[3] North East Thames Regional Genetics Service. Limitations of cytogenetic testing 2011:1–2.

[4] Zmorzyński S, Filip AA, Koczkodaj D, Michalak M. Molekularne i cytogenetyczne czynniki prognostyczne w ostrej białaczce szpikowej (OBS). Postepy Hig Med Dosw 2011;65:158–66. doi:10.5604/17322693.935753.

[5] Kumar CC. Genetic abnormalities and challenges in the treatment of acute myeloid leukemia. Genes Cancer. 2011;2(2):95-107. doi:10.1177/1947601911408076

[6] https://www.genome.gov/genetics-glossary/Karyotype

[7] Thirumulu Ponnuraj, Kannan. (2011). Cytogenetic Techniques in Diagnosing Genetic Disorders. 10.5772/17481

[8] https://imagebank.hematology.org/image/60285/karyotype-t69